Genredigering/CRISPR: Teknologien

 

Genredigering er en samlebetegnelse på genteknologier som tillater å gjøre målrettede endringer i arvestoffet til en organisme. Teknologien er blant annet forventet å få betydning for hvordan vi behandler sykdom i mennesker i fremtiden. Denne teksten tar for seg hvordan genredigering kan brukes i andre organismer, særlig innen landbruk og matproduksjon.

Den genredigeringsmetoden som har hatt størst påvirkning på feltet de siste årene er CRISPR-teknologien. CRISPR vil derfor beskrives og diskuteres i større detalj enn andre teknikker. Likevel vil mange av prinsippene og problemstillingene som diskuteres i dokumentet gjelde generelt for alle genredigeringsteknikkene.

Lett tilgjengelig teknologi

Teknologisk utvikling gjør at mange av de nye genredigeringsteknikkene tas i bruk i økende omfang. Spesielt CRISPR-teknologien, som kun er få år gammel, har blitt svært populær. I tillegg til at den gir større muligheter til å lage ulike genetiske endringer enn andre teknologier, er den også billigere og enklere å bruke. Det som trengs for å gjøre eksperimentene kan kjøpes for noen hundrelapper på nett[1], og kan anvendes av alle som har grunnkompetanse i molekylærbiologi. I tillegg selges såkalte do-it-yourself-kits, der hvem som helst kan kjøpe CRISPR-pakker på nett for å lage genredigerte mikroorganismer hjemme.[2],[3] Metodeutviklingen på feltet går også svært raskt. Både presisjonen, effektiviteten og bredden i bruksområder øker kontinuerlig.

Fakta GENCRISPR-teknologien tas i bruk i forskningslaboratorier og av industrien i stadig større grad – det anslås at den er i bruk i over 40 000 forskningslaboratorier på verdensbasis[4]. Metodens tilgjengelighet gjør også at det er en større bredde i aktørene som tar genteknologi i bruk nå enn før. Dette gjenspeiles i antallet vitenskapelige publikasjoner der CRISPR er anvendt, som øker kraftig. På de årene som har gått siden metoden ble utviklet i 2012 har antallet forskningsartikler tilnærmet doblet seg årlig, med over 2000 publisert i 2016.

CRISPR-metoden er spesiell fordi den kan brukes i alle levende organismer, i alle celletyper. Metoden kan også brukes til å endre flere gener samtidig. CRISPR-metoden ble kåret til årets vitenskapelige gjennombrudd i 2015 av det verdensledende vitenskapelige tidsskriftet Science[5].

 

Genredigering med CRISPR – hvordan fungerer det?

fakta crispr inn i cellenCRISPR er en forkortelse for Clustered Regularly Interspaced Short Palendromic Repeats, og beskriver et system som finnes i en rekke bakterier. Bakteriene bruker systemet som et slags immunforsvar mot virus. I 2012 viste forskere at dette systemet kan brukes til å målrettet endre DNA i alle typer organismer[6],[7]. Man trenger i praksis to komponenter: en kort RNA-tråd kalt sgRNA (single-guide RNA) og et tilhørende enzym som kan kutte DNA. Når disse komponentene kommer inn i cellekjernen, der cellens DNA befinner seg, binder sgRNA-tråden seg til en matchende DNA-sekvens. Deretter kutter enzymet i DNA-et akkurat der sgRNA-tråden har bundet seg. Kuttet som lages er likt kutt som oppstår tilfeldig under celledeling eller som følge av skader fra for eksempel UV-stråling eller kjemiske stoffer.

For å unngå at slike brudd får katastrofale konsekvenser, har cellene utviklet effektive reparasjonssystemer. Som oftest vil cellen «lime» sammen DNA-tråden igjen. Dette er imidlertid en ganske upresis prosess, og resulterer ofte i at små deler av DNAet fjernes eller legges til på tilfeldig vis. Dette kalles en mutasjon.

Oppstår det en mutasjon i et gen, kan det føre til at genet inaktiveres. Slik kan man dermed målrettet slå ut enkeltgener.

Istedenfor å lime sammen kan cellen reparere bruddet ved å sette inn en kort DNA-bit i bruddsonen. Slik kan man bytte ut, legge til eller endre gener slik man ønsker, for eksempel innføre en bestemt mutasjon. Denne måten å reparere en skade på er normalt mindre effektiv enn å lime sammen, og foregår hovedsakelig i celler som deler seg.

 

FIGUR 1: Genredigering med CRISPR

SAKEN FORKLART:

Ved genredigering med CRISPR kuttes DNA-et av et enzym kalt Cas9. Det er et spesielt RNA-molekyl (kalt sgRNA) som bestemmer hvor kuttet lages ved å binde seg til en matchende sekvens i DNA-et. Man kan derfor selv bestemme hvor DNA-et skal kuttes. Cellen liker ikke kuttet DNA, så den iverksetter systemer for å reparere det. Ved å manipulere denne prosessen kan man ta vekk, bytte ut, eller legge til DNA i kuttsonen, for eksempel bytte ut en sykdomsgivende mutasjon med en frisk DNA-sekvens.

 

 

fakta ulike crisprvarianterfakta andre genredmetoder

Effektivitet og presisjon

Genredigering som metode har enkelte tekniske begrensninger. Blant annet er effektiviteten (suksessraten) ved genredigering avhengig av metode, celletype og hvor i arvestoffet endringen skal skje.

For CRISPR-metoden er effektiviteten ved inaktivering av gener generelt høy, men for innsetting av nytt DNA er den mer variabel. Nylige metodeforbedringer har imidlertid økt effektiviteten, og studier viser at man nå kan oppnå brukbar effektivitet i både plante- og dyreceller.[8],[9],[10],[11],[12]

fakta metodeforbedringer

En annen variabel er presisjonen i metoden – at den kutter der den skal. CRISPR gjenkjenner som oftest en DNA-sekvens på omkring 20 nukleotider, som statistisk sett er unik i arvestoffet. Likevel kan Cas9 i utgangspunktet binde seg til og kutte DNA-sekvenser som har små forskjeller fra målsekvensen, og dermed lage uønskede kutt i DNA.[13]

Det har derfor blitt investert betydelige ressurser i å forbedre metoden, for å unngå at det oppstår utilsiktede endringer (se tilleggsboks). Resultatet er at man nå kan oppnå svært lav feilrate i mange celletyper, også fra planter og dyr.[14],[15],[16],[17],[18],[19] ,[20] Mange forskere jobber med å kartlegge detaljene for hvordan CRISPR fungerer, og hvilke faktorer som påvirker effektivitet og presisjon.fakta kontroversiell studie

Fordi det likevel alltid vil være en statistisk mulighet for at utilsiktede endringer kan oppstå, vil det ofte være ønskelig å verifisere at man kun har gjort de tilsiktede endringene. Dette er mulig med DNA-sekvensering som nå tillater kartlegging av hele arvestoffet i en celle med stor nøyaktighet. Slik kan man undersøke nøyaktig hvilke endringer som har oppstått.[21],[22],[23]

 

Hva skiller genredigering fra andre metoder? 

Tradisjonell avl: Genetisk variasjon er grunnlaget for all dyreavl og planteforedling. For organismer som formerer seg gjennom seksuell reproduksjon blir avkommet en genetisk blanding av foreldrene. Slik kan man målrettet kombinere gunstige egenskaper fra ulike individer. I tillegg skapes genetisk variasjon av at biter av DNA-et bytter plass når kjønnsceller lages, og gjennom spontane mutasjoner. Mutasjonsraten varierer, men er ganske lik innen grupper av organismer. For høyerestående organismer som dyr og planter oppstår ca 0,1-100 mutasjoner fra en generasjon til den neste, avhengig av størrelsen på genomet.[24] I ris er for eksempel raten rundt 20 mutasjoner per generasjon.[25]

Mutagenese med stråling / kjemikalier: Fra 1920-tallet har det blitt brukt stråling og kjemikalier for å skape mutasjoner med tanke på å oppnå ny genetisk variasjon i kulturplanter. Dette skjer ofte ved at DNA-et får et såkalt dobbelttrådbrudd, et kutt, som så repareres av cellens eget reparasjonsmaskineri. Feil under denne reparasjonsprosessen fører til mutasjon, på samme måte som ved genredigering. Ved bruk av stråling og kjemikalier oppstår det mange, ofte hundre- eller tusenvis, av mutasjoner tilfeldige steder i arvestoffet.[26],[27] De fleste mutasjoner er enten skadelige eller har ingen effekt, men i blant kan det oppstå mutasjoner som gir ønskede egenskaper, som kan brukes i videre foredling. Ifølge oversikten til FAO (FNs mat- og landbruksorganisasjon) og IAEA (det internasjonale atomenergibyrået) har over 3000 plantesorter fra over 200 ulike arter i mer enn 60 land blitt foredlet fram på denne måten og satt ut i naturen. Over 1000 sorter er viktige matplanter som raps, ris og bygg, og mange er kommersielt tilgjengelige.[28]

Innsetting av gener med klassisk genmodifiseringsteknologi: De første metodene for genmodifisering, som ble utviklet på 1970- og 80-tallet, baserer seg på å sette hele gener inn i arvestoffet til en celle. I planter brukes ofte bakterier som bærere av det genetiske materialet, eller det overføres ved hjelp av kjemikalier, elektrisitet eller med en såkalt genkanon. I dyreceller brukes også kjemikalier eller elektrisitet, genmaterialet kan sprøytes inn ved såkalt mikroinjeksjon, eller det kan overføres ved hjelp av virus. Felles for slike metoder er at genene blir tilfeldig plassert i arvestoffet. Figuren under sammenligner klassisk genmodifisering med genredigering.

FIGUR 2: Sammenligning av klassisk genmodifisering og genredigering

CRISPR vs GMO faktabank fig 2

SAKEN FORKLART:

Ved klassisk genmodifisering settes nye gener inn i arvestoffet til en celle, men man har ofte ikke kontroll på hvor genene havner, eller hvor mange kopier som settes inn. Dette kan ha uforutsigbare effekter på cellen. Ved genredigering kan man bestemme hvor i arvestoffet endringen skjer. Man er heller ikke begrenset til å sette inn nye gener, men kan også gjøre endringer på eksisterende gener. For eksempel kan man ta bort et gen man ikke ønsker, eller man kan bytte ut deler av et gen for å endre dets funksjon. Dette gir en mye større grad av kontroll og fleksibilitet.

 

 

 

Tidsbruk og kostnader

Hvor lang tid det tar å utvikle nye planter og dyr vil være avhengig av både type organisme (f.eks. generasjonstid) og hvilken metode man bruker. Et eksempel er vist under, der hornløse kyr kan fremskaffes ved hjelp av henholdsvis tradisjonell avl og genredigering.

Eksempel – Hornløse (kolla) kyr:

Mange storferaser har horn. Av dyrvelferdsmessige og praktiske årsaker blir kalvene ofte avhornet når de er små, men prosessen kan være smertefull for dyrene. [29],[30] Hos Norsk Rødt Fe finnes genvarianter som gir hornløse kyr, og disse har blitt målrettet krysset inn i en stor andel av bestanden.[31] Hos andre raser slik som Holstein melkekyr, finnes ikke slike genvarianter. Studier viser at de som driver med oppdrett av melkekyr i USA ønsker genvarianten som gir hornløse kyr, men vegrer seg fra å krysse den inn fra andre feraser siden det vil ta lang tid (estimert 20 år) å krysse ut andre uønskede genvarianter som følger med[32]. I 2015 lagde forskere hornløse Holstein-kyr ved hjelp av genredigering,[33] og fikk dermed den ønskede genetiske sammensetningen allerede i første generasjon. DNA-sekvensering bekreftet at det ikke samtidig hadde skjedd andre endringer i arvestoffet. Dyrene er ikke enda tatt inn i produksjon. Figuren under sammenligner prosessene med å fremskaffe hornløse melkekyr gjennom tradisjonell avl og genredigering. Samme prinsipp vil gjelde for andre naturlig forekommende genvarianter i andre organismer.

polled_cow fig 3

SAKEN FORKLART:

Dersom man skal få en genetisk egenskap, i dette tilfellet genet som gir hornløshet, inn i en ny organisme ved hjelp av tradisjonelle metoder, må den krysses inn. Når to foreldreorganismer pares, én med og én uten horn, vil avkommet få halvparten av sitt genetiske materiale fra hver av foreldrene. For å fjerne de andre uønskede genetiske egenskapene som ble arvet fra den hornløse forelderen må deretter et hornløst avkom tilbakekrysses med et hornet individ. Og slik må man fortsette helt til man har oppnådd en ønsket genetisk sammensetning, med genvarianten for hornløshet i en tilnærmet opprinnelig genetisk bakgrunn fra et hornet individ. Avhengig av organismens generasjonstid kan dette være svært tidkrevende. For stofe anslås det å ta rundt 20 år. Med genredigering kan den ønskede genetiske sammensetningen oppnås i første generasjon.

 

Kostnader og tid for å få et produkt på markedet vil avhenge av hvordan organismen oppfører seg utenfor laboratoriet. Dette er i utgangspunktet uavhengig av hvilken metode som er brukt til å fremstille den, men vil variere med egenskapen som er endret. Fremstillingsmetoden vil imidlertid påvirke kostnader og tid knyttet til hvilke krav som stilles til godkjenning av organismen (se eget dokument om juridiske aspekter ved genredigering) [lenke].

 

Eksempler på genredigerte dyr og planter

Klassisk genmodifisering har i hovedsak vært begrenset til å tilføre nytt genetisk materiale til organismer, og hovedvekten av produktene så langt har vært sprøytemiddel- og insektsresistente planter. Nye genteknologier, spesielt genredigering, gir muligheter til å utvikle organismer med et større spenn av egenskaper enn tidligere. Følgende er et utvalg eksempler på produkter som har blitt fremstilt med genredigering og som det forskes på med genredigering. Flere av dem er egenskaper det også har blitt jobbet med tidligere med kryssing/avl, mutagenese, eller «tradisjonell» genmodifisering, andre er egenskaper det kun er mulig å oppnå med nye teknikker (som for eksempel å ta vekk egenskaper ved å «slå ut» et gen). En rekke forskningsmiljøer og bedrifter forventes å søke om godkjenning for slike produkter i løpet av de neste fem-ti årene1.

 

Sykdomsresistente dyr og planter:

– Griser som er resistente mot Porcine Reproductive and Respiratory Syndrome Virus (PRRS) [34],[35] og Afrikansk svinepest[36]

– Ris,[37] hvete[38] og tomater[39] som er motstandsdyktige mot soppinfeksjon.

– Agurk som er motstandsdyktig mot virusinfeksjon[40]

– Sitrusfrukter som er motstandsdyktige mot bakterieinfeksjon[41]

 

Planter med endret næringsinnhold:

– Mais med redusert innhold av fytat (som øker opptaket av fosfor i husdyr som spiser den)[42]

– Poteter som gir redusert innhold av kreftfremkallende akrylamid ved varmebehandling[43]

– Raps som produserer olje med mindre mettet fett[44]

– Hvete med redusert gluteninnhold[45]

– Ris med høyere innhold av amylose (som kan forebygge diabetes og hjerte- og kar-sykdommer)[46]

 

Planter med økt produktivitet:

– Tomater som blomstrer oftere (og derfor produserer mer) per sesong[47]

– Mais som vokser bedre under tørke[48]

– Ris som produserer flere korn per plante[49]

 

Dyr med andre egenskaper:

– Storfe uten horn (for å unngå av-horning)[50]

– Kjønnsløs oppdrettslaks (for å unngå genetisk innblanding i ville laksestammer) [51]

– Kashmir-geiter med tykkere pels[52]

– Forsøksdyr som modeller for menneskelig sykdom for å studere mutasjoner som gir sykdom, og å utvikle nye medisinske behandlinger.[53]

 

Sprøytemiddelresistente planter:

– Raps som tåler sprøytemidler med virkestoffet sulfonylurea[54]

 

I Norge er ikke genredigering tatt i bruk utenfor laboratoriet, men det gjøres blant annet forskningsforsøk på laks ved Havforskningsinstituttet. Der har de lykkes med å lage steril laks uten kjønnsceller ved å fjerne deler av et gen med CRISPR-metoden[55]. Det foreløpig ikke planlagt at dette skal brukes i produksjon, men forskerne bak arbeidet ønsker å utforske muligheten til å endre gener i laks for å gjøre dem mer motstandsdyktige mot lakselus og virussykdom. Du kan lese om dette, samt eksempler på andre fagmiljøer som også vurderer å ta i bruk genredigering i dyr og planter her [hyperlenke].

Det er fortsatt for tidlig å si hvilke av forskningsprosjektene som vil lykkes, men det investeres betydelige ressurser i forskning og utvikling på genredigerte dyr og planter i store deler av verden, som USA og Kina. Det forventes derfor at vi vil se flere nye varianter i tiden som kommer.

 

[1] https://www.addgene.org/crispr/

[2] http://www.the-odin.com/diy-crispr-kit/

[3] https://www.wsj.com/articles/diy-gene-editing-fast-cheapand-worrisome-1488164820

[4] Forelesning om optimalisering av CRISPR under European Society for Human Genetics (ESHG)-konferanse 24.mai 2016. R. Doyle, Desktop Genetics, UK.

[5] https://www.sciencemag.org/news/2015/12/and-science-s-breakthrough-year

[6] Jinek et al (2012) A programmable dual-RNA-guided DNA endonuclease in adaptive bacterial immunity. Science 337.

[7] Cong et al (2013) Multiplex genome engineering using CRISPR/Cas systems. Science 339.

[8] Liang et al (2016) Selection of highly efficient sgRNAs for CRISPR/Cas9-based plant genome editing. Scientific Reports 6.

[9] Eid et al (2016) High efficiency of targeted mutagenesis in arabidopsis via meiotic promotor-driven expression of Cas9 endonuclease. Plant Cell Reports.

[10] Maruyama et al (2015) Increasing the efficiency of precise genome editing with CRISPR-Cas9 by inhibition of nonhomologous end joining. Nature Biotechnology 33.

[11] Chu et al (2015) Increasing the efficiency of homology-directed repair for CRISPR-Cas9-induced precise gene editing in mammalian cells. Nature Biotechnology 33.

[12] Tao et al (2016) Efficient biallelic mutation in porcine parthenotes using a CRISPR-Cas9 system. Biochem Biophys Res Commun.

[13] Wang et al (2015) Unbiased detection of off-target cleavage by CRISPR-Cas9 and TALENs using integrase-defective lentiviral vectors. Nature Biotechnology 33.

[14] Yee (2016) Off-target effects of engineered nucleases. FEBS Jounal, in press.

[15] Pan et al (2016) CRISPR/Cas9-mediated efficient and heritable mutagenesis in tomato plants in the first and later generations. Scienrific Reports 6.

[16] Xu et al (2015) Generation of inheritable and “transgene clean” targeted genome-modified rice in later generations using the CRISPR/Cas9 system. Scientific Reports 5.

[17] Wang et al (2016) One-step generation of triple gene-targeted pigs using CRISPR/Cas9 system. Scientific Reports 6.

[18] Bolukbasi et al (2016) Creating and evaluating accurate CRISPR-Cas9 scalpels for genomic surgery. Nature Methods 13.

[19] Zhu et al (2016) Efficiency and inheritance of targeted mutagenesis in maize using CRISPR-Cas9. Journal of genetics and genomics 20.

[20] Kaya et al (2016) Highly specific targeted mutagenesis in plants using Staphylococcus aureus Cas9. Scientific Reports.

[21] Kanchiswamy et al (2016) Fine-tuning next-generation genome editing tools. Trends in Biotechnology 1370.

[22] Yee (2016) Off-target effects of engineered nucleases. FEBS Jounal, in press.

[23] Tsai et al (2015) GUIDE-seq enables genome-wide profiling of off-target cleavage by CRISPR-Cas nucleases. Nature Biotechnology 33.

[24] Baer et al (2007) Mutation rate variation in multicellular eukaryotes: causes and consequences. Nature Reviews Genetics 8.

[25] Yang et al (2015) Parent–progeny sequencing indicates higher mutation rates in heterozygotes. Nature 523.

[26] Till et al (2007) Discovery of chemically induced mutations in rice by TILLING. BMC Plant Biol. 7.

[27] Cooper et al (2008) TILLING to detect induced mutations in soybean. BMC Plant Biol. 8.

[28] http://www-naweb.iaea.org/nafa/pbg/index.html

[29] Stafford og Mellor (2005) Dehorning and disbudding distress and its alleviation in calves. Vet J 169.

[30] Stafford and Mellor (2011) Addressing the pain associated with disbudding and dehorning in cattle. Appl. Anim. Behav. Sci. 135.

[31] http://www.geno.no/Start/Geno-Avler-for-bedre-liv/om-nrf-kua/Kollethet-og-farge/

[32] Spurlock et al (2014) The impact of 3 strategies for incorporating polled genetics into a dairy cattle breeding program on the overall herd genetic merit. J Dairy Sci. 97.

[33] Carlson et al (2016) Production of hornless dairy cattle from genome-edited cell lines. Nature Biotechnology 34.

[34] Whitworth et al (2016) Gene-edited pigs are protected from porcine reproductive and respiratory syndrome virus. Nature Biotechnology 34.

[35] Burkard et al (2017) Precision engineering for PRRSV resistance in pigs: Macrophages from genome edited pigs lacking CD163 SRCR5 domain are fully resistant to both PRRSV genotypes while maintaining biological function. PLoS Pathogen 13.

[36] Lillico et al (2013) Live pigs produced from genome edited zygotes. Scientific Reports 3.

[37] Li et al (2012) High-efficiency TALEN-based gene editing produces disease-resistant rice. Nat Biotechnology 30.

[38] Wang et al (2014) Simultaneous editing of three homoeoalleles in hexaploid bread wheat confers heritable resistance to powdery mildew. Nature Biotechnology 32.

[39] Nekrasov et al (2017) Rapid generation of a transgene-free powdery mildew resistant tomato by genome deletion. Scientific Reports 7.

[40] Chandrasekaran et al (2016) Development of broad virus resistance in non-transgenic cucumber using CRISPR/Cas9 technology. Mol Plant Pathol. 17.

[41] Jia et al (2016) Genome editing of the disease susceptibility gene CsLOB1 in citrus confers resistance to citrus canker. Plant Biotechnol J.

[42] Liang et al (2014) Targeted mutagenesis in Zea mays using TALENs and the CRISPR/Cas system. J Genet Genom. 41.

[43] Clasen et al (2016) Improving cold storage and processing traits in potato through targeted gene knockout. Plant Biotechnol J. 14.

[44] http://www.calyxt.com/products/lower-saturated-fat-canola-oil/

[45] http://www.calyxt.com/products/gluten-reduced-wheat/

[46] Sun et al (2017) Generation of High-Amylose Rice through CRISPR/Cas9-Mediated Targeted Mutagenesis of Starch Branching Enzymes. Front Plant Sci. 8.

[47] Soyk et al (2016) Variation in the flowering gene SELF PRUNING 5G promotes day-neutrality and early yield in tomato. Nature Genetics.

[48] Shi et al (2017) ARGOS8 variants generated by CRISPR-Cas9 improve maize grain yield under field drought stress conditions. Plant Biotechnol J. 15.

[49] Li et al (2017) Generation of targeted point mutations in rice by a modified CRISPR/Cas9 system. Mol Plant.

[50] Carlson et al (2016) Production of hornless dairy cattle from genome-edited cell lines. Nature Biotechnology 34.

[51] Wargelius et al (2016) Dnd knockout ablates germ cells and demonstrates germ cell independent sex differentiation in Atlantic salmon. Scientific Reports 6.

[52] Wang et al (2016) Disruption of FGF5 in Cashmere Goats Using CRISPR/Cas9 Results in More Secondary Hair Follicles and Longer Fibers. PLoS One.

[53] Dow (2016) Modeling disease in vivo with CRISPR/Cas9. Trends in Molecular Medicine 21.

[54] www.cibus.com

[55] Wargelius et al (2016) Dnd knockout ablates germ cells and demonstrates germ cell independent sex differentiation in Atlantic salmon. Scientific Reports 6.

Siden ble opprettet: 16.08.2017. Siden ble oppdatert: 22.08.2017

© 2017 Bioteknologirådet. | Design: Tank - Utviklet av: Spekter